Western Blot技术服务实验流程

Western Blot实验流程

1、蛋白质抽提

A、实验对象为组织样品，取适量（250-500mg）新鲜组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白。

B、实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白。

2、蛋白质定量

按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)

将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进*个孔中，电泳分离蛋白。

4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜

5、膜的封闭和抗体孵育

A、膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

B、封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。

C、加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6、结果检测

化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

7、数据分析

目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

8、提供实验报告

包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。

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