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定量检测科研血清IgG蛋白质芯片的研制及应用研究

 随着人类基因组测序工作的完成,对基因表达产物蛋白质的研究已成热点。为揭示众多蛋白质的作用和相互关系,从而真正解释基因功能,以蛋白质组学为核心的后基因组研究已成为必然趋势。蛋白芯片(protein chip)是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在玻片上,形成蛋白质的微阵列,即蛋白质芯片,带有特殊标记的蛋白质分子(抗体或抗原)与之特异性结合,通过对标记物的检测来实现抗原抗体的高通量互检。该技术所需蛋白质的量极少,检测反应相对较快,具有通量化,稳定性较好,灵敏度较高。

目前在国内外这方面的研究都才刚刚起步。蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物,比基因芯片更接近生命活动的物质层面,因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。同时由于蛋白质芯片可利用微量生理或生物采样即可同时检测不同的蛋白质分子和蛋白质分子之间的相互作用,获得各种条件下蛋白质组的变化.进而得以对基因的表达情况及基因功能进行深入研究。高通量定量检测的蛋白质芯片是研究检测和实验研究*工具,本研究为研制玻片为载体的高通量蛋白质芯片,以科研血清IgG为研究模型,建立定量检测蛋白质芯片技术平台,并应用于科研血清IgG的检测,其检测结果与传统的ELISA方法比较。

研究内容分两个部分,1.介质表面修饰对蛋白质芯片固定率和反应性的影响。2.定量检测科研血清IgG蛋白质芯片研制及应用研究。 *部分:对zui常用的三种玻璃表面化学修饰方法对蛋白质芯片质量的影响进行评价。为研制评价蛋白质固定效率的芯片,用Cy3标记的山羊抗人IgG抗体样品,用含40%甘油的PBS溶液稀释成为0.5 mg/L,0.75 mg/L,1 mgm,1.25 mg/L,1.5 mg╱L,1.75 mg╱L,2.0 mg╱L等浓度。取戊二醛、poly-L-lysine,GTPS环氧基修饰的玻片各一块,按上述浓度点样,每一浓度点1列3点,形成3×7的阵列,点样过程的温度为室温(25℃),湿度为30%～40%。点样完成后,将玻片放入湿盒中进行温浴4h,晾干,用Genepix4000B扫描仪获取荧光图象。取出玻片,用PBST(PBS中含0.1%Tween-20)清洗3遍,每次5 min,再用PBS清洗5 min,晾干,再用Genepix4000B扫描仪获取荧光图象。 为研制评价蛋白质反应性的芯片,用倍比稀释法,连续科研血清lgG样品分别至3.125mg╱L,6.25mg/L,12.5mg/L,25mg╱L,50mg/L,100mg╱L等浓度,在戊二醛、poly-L-lysine修饰的玻片点样,每一浓度点1列3点,形成3×7的阵列,点样过程的温度为室温(25℃),湿度为30%～40%。点样完成后,将玻片放入湿盒中进行:37℃温浴4h,晾干,用1%BSA(质量体积比)作封闭,将玻片放入封闭液反应1h,降低非特异性吸附,用PBST(PBS中含0.1%Tween-20)清洗3遍,每次5min,再用PBS清洗5 min,将戊二醛修饰的破片用0.2%的硼化钠还原Schiff碱形成更稳定的单键结构。取Cy3 goat-anti-human IgG(0.5 mg╱L)1.6μl到芯片阵列的表面,用盖玻片压匀,放入湿盒中进行37℃温浴1h,取出用PBST(PBS中含0.1%Tweon-20)清洗3遍,每次5 min,再用PBS清洗5 min,晾干,扫描仪获取荧光图象。三种修饰方法的芯片均可使蛋白质保持较好的固定效率和反应活性,由共价键偶联的戊二醛修饰玻片不仅有更高的反应活性,而且图象佳,但背景略高。预点样10个拷贝点后,各蛋白质样品的荧光测量值趋于稳定,可正式点样。点样后的固定时间以24-48h为宜。时间过长或过短均会导致荧光测量值偏低。使用1%BSA封闭缓冲液的封闭效果。*的抗原一抗体特异性结合反应温度为37 0C、时间为2h,选择1mg/ml作为*的点样浓度。

综合评价,戊二醛修饰的蛋白质芯片优于多聚赖氨酸修饰芯片,醛基修饰的蛋白质芯片用于科研和研究蛋白质检测是可行的,这为蛋白质芯片的应用开发提供选择的依据但应当探讨如何降低醛基修饰芯片的背景这对于提高蛋白质芯片的敏感性和信噪比,具有重要意义,此方面技术有待进一步探索。 第二部分:建立定量检测科研血清IgG蛋白质芯片的技术平台。为研制定量检测科研血清IgG蛋白质芯片,选择醛基修饰的城片为载体,蛋白质样品溶解于20%甘油的PBS,由机械手将浓度为0.5 mg/ml人IgG单克隆抗体点样在玻片上,科研血清白蛋白为阴性对照,以1%的BSA为封闭液对蛋白质芯片进行封闭,并经相应处理,构建用于定量检测科研血清lgG蛋白质芯片。以IgG标准品为检测对象,建立蛋白质芯片方法和ELISA方法的标准曲线,分别用蛋白质芯片方法和ELISA方法检测10例科研血清IgG。将纯化的羊抗人IgG 0.5mg/ml 30%甘油/PBS,点样在经硝酸纤维素修饰的片基上,以科研血清白蛋白为阴性对照,用1%BSA封闭,制备定量检测科研血清IgG的蛋白质芯片;同时用ELISA检测科研血清IgG。SPSS 10.0软件分析蛋白质芯片和ELISA的试验结果,采用单因素方差分析两组间相关性。结果显示蛋白质芯片和ELISA校准曲线的R~2值分别是0.996和0.994。两种方法检测的10例科研血清IgG含量,其检测限均在1.56μg╱100μL。用单因素方差分析结果显示f=0.188,P=0.670＞0.05,表明两组间差异无显著性意义,具有很好的一致性。本研究以科研血清IgG为模型,比较蛋白质芯片与ELISA在定量分析中的效果,显示出二者的高度相关性。抗体芯片的基础在于包被于芯片基质上的抗体的有效数量和活性,作为蛋白质芯片技术中应用前景的抗体芯片技术,在定量分析中有一定的优势。