考马斯亮蓝法测蛋白含量的正确使用方法！

考马斯亮蓝法测蛋白含量的正确使用方法！

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在595nm处有最大吸收峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

使用所需设备：

产品组成：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

标准品：液体×1瓶，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取：

液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

组织样品：准确称取约0.1 g样品，加1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水），冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

吸光值测定：

1. 分光光度计预热30 min以上，蒸馏水调零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸馏水，250μL试剂一，混匀后室温静置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，记为A空白管。

3. 标准管：取0.5mL EP管，加入40μL标准液，250μL试剂一，混匀后室温静置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，记为A标准管。

4. 测定管：取0.5mL EP管，加入40μL待测液，250μL试剂一，混匀后室温静置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，记为A测定管。

蛋白质含量计算公式：

C待测（µg/m L）= C标准管×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

                =50×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

C标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。

注意事项：

1.加考马斯亮蓝后，在10~20min内吸光值相对较稳定，因此须在10~20min完成比色。

2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用95%乙醇冲洗。

3.测定前用1~2个样做预实验，确保蛋白浓度在0~100µg/ml范围内，否则需要做相应稀释。