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上海信帆生物开展了：ATP含量测试盒操作培训活动
本周上海信帆生物销售部门针对“ATP含量测试盒”开展了一系列的操作培训活动，包括检测原理，检测意义，试剂盒组成，样本的前处理，如何计算数值，操作步骤，计算举例等等，通过这次培训，让大家对该产品有了更加深刻的认识，也明白了该试剂盒操作的一些注意事项，方便在以后的工作中开展活动，也方便更加清楚明了的回复各位客户的问题。本次活动得到公司领导和员工的*！
ATP含量测试盒说明(100管/48样)
一、检测意义
三磷酸腺苷(adenosine 5-triphosphate,ATP)是生物体内能量转换基本的载体,其含量的变化直接关系到各器官的能量代谢。ATP作为重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变,会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下,ATP水平会下降,而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降,在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生状态。ATP含量测定试剂盒可以用于检测红细胞或组织内的ATP水平。
二、测定原理:肌酸激酶催化三磷酸腺苷和肌酸,生成磷酸肌酸,用磷钼酸比色法进行检测
三、试剂组成及配制:(100管/48样)(本试剂盒附送双蒸水一瓶,供客户配试剂时使用)
| 组分 | 规格 | 保存 |
试剂一 | 底物液I | 粉剂×1瓶 | 室温保存 |
底物液I配制:用时加10mL煮沸双蒸水溶解,并沸水浴使溶解*;临用前观察如有结晶,可沸水浴溶解后置于37°C保存待测。 | |||
试剂二 | 底物液Ⅱ | 20mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 促进剂 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
稀释液760uL×2瓶 | 4℃保存 | ||
试剂三应用液(促进剂)配制:临用前取1支试剂三稀释液加入1支试剂三粉剂中,充分溶解备用 | |||
试剂四 | 沉淀剂 | 液体5.5mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 显色剂 | 甲液7mLx4瓶 | 4℃保存 |
乙液6mLx4瓶 | 4℃保存 | ||
显色应用液的配制:用时取一瓶显色剂甲液加入一瓶显色剂乙液中,充分混匀4℃待用,现用现配 | |||
试剂六 | 终止液 | 50mL×1瓶 | 室温保存 |
试剂七 | ATP标准品 | 粉剂×2支 | 4℃保存 |
5mmol/L ATP标准品贮备液配制:用时每支加双蒸水lmL,制备5mmol/L ATP标准品贮备液。 | |||
1mmol/L ATP标准品应用液配制:将标准品贮备液与双蒸水1:4稀释,即5倍稀释。 | |||
试剂八 | 双蒸水 | 40mL×1瓶 | 4℃或室温保存 |
注:本试剂盒中ATP 试剂三粉剂-20℃冷冻保存,其余试剂4℃保存,有效期3个月,开封后有效期为1个月。
四、样本前处理:
1、红细胞:抗凝全血取下层压积红细胞,一般按1:4的体积比加双蒸水进行稀释,再 混匀使溶血*,制备成溶血液。将制好的溶血液加入玻璃试管中沸水加热煮10分钟,取出混匀抽提1分钟,4000转/分钟离心10分钟,取上清液待测。
2、组织样本:准确称取组织称重,按重量(g):体积(mL)=1：9的比例,加入9倍体积的沸双蒸水,制成10%的匀浆液,再置于沸水浴中煮10分钟,取出混匀抽提1分钟,3500转/分离心10分钟,取上清液待测。
3、培养细胞:先离心处理将细胞与培养上清分离,除去培养上清,得到下层沉淀细胞(一般细胞数量达到106),将收集好的细胞加入300~500uL热双蒸水,置于热水浴
(90-100°℃)中匀浆破碎,后将细胞悬液于沸水浴中加热10分钟,取出混匀抽提
1分钟,即可用于测定(如果存在大块细胞碎片,需离心后取上清测定)。
注:混匀抽提1分钟即为漩涡混匀1分钟。
五、操作步骤:
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | 对照管 |
1mmol/L标准液 (μL) | 30 | 30 |
|
|
样本(uL) |
|
| 30 | 30 |
试剂一:底物液I (μL) | 100 | 100 | 100 | 100 |
试剂二:底物液Ⅱ (μL) | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂三:促进剂 (μL) |
| 30 | 30 |
|
双蒸水(μL) | 30 |
|
| 30 |
混匀，37℃水浴30分钟 | ||||
试剂四:沉淀剂(μL) | 50 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀后,4000rpm离心5分钟,取上清液300μL进行测定 | ||||
上清液(μL) | 300 | 300 | 300 | 300 |
试剂五：显色应用液(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀,室温静置2分钟 | ||||
试剂六:终止剂(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀,室温静置5分钟,波长636nm,光径0.5cm,双蒸水调零,测定各管吸光度值
注:在比色前，比色皿用自来水洗10余次,再用双蒸水洗4~5次,以免磷污染
六、简便操作表:(如果样本量大,建议将试剂混合后再按照该表进行操作)
1、混合试剂配制:
工作液A: 按试剂一:试剂二:试剂三=100:200:30的比例配制,现用现配,用多少配多少
工作液B: 按试剂一:试剂二=100:200的比例配制,现用现配,用多少配多少
2、混合试剂配制*后按下表操作
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | 对照管 |
1mmol/L标准液(μL) | 30 | 30 |
|
|
样本(μL) |
|
| 30 | 30 |
工作液A(μL) |
| 330 | 330 |
|
工作液B(μL) | 300 |
|
| 300 |
双蒸水(μL) | 30 |
|
| 30 |
混匀，37℃水浴30分钟 | ||||
试剂四:沉淀剂(μL) | 50 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀后,4000rpm离心5分钟,取上清液300μL进行测定 | ||||
上清液(μL) | 300 | 300 | 300 | 300 |
试剂五：显色应用液(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀,室温静置2分钟 | ||||
试剂六:终止剂(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀,室温静置5分钟,波长636nm,光径0.5cm,双蒸水调零,测定各管吸光度值。
注:在比色前，比色皿用自来水洗10余次,再用双蒸水洗4~5次,以免磷污染。
七、注意事项:
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。对测定所用试管要求严格,要求不能有任何磷污染,建议使用全新一次性塑料试管,避免磷污染是检测成败的关键;
2、显色应用液配好后,不可放置太久,一般可保存五天,好现用现配。随时放冰箱
3、组织匀浆宜用2%~5%浓度的匀浆上清,若样本浓度过高,则底色过深(对照管OD过高)需稀释后再进行测定;一般通过做预试验将对照OD值控制在1.0以下
上海信帆生物开展了：ATP含量测试盒操作培训活动
