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JC-1法检测线粒体膜电位,以及检测线粒体膜电位的操作步骤
更新时间:2018-05-22   点击次数:13966次

JC-1法检测线粒体膜电位,以及检测线粒体膜电位的操作步骤!

 

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一种以 JC-1 为荧光探针,快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒,可以用于早期的细胞凋亡检测,CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于研究诊断或其他用途。

 

产品组成:

 

编号

50T

100T

Storage

名称

 

 

 

试剂(A): JC-1 Stain(200×)

3×100μl

5×100μl

-20℃ 避光

 

 

 

 

试剂(B): JC-1 Buffer(5×)

40ml

80ml

4℃

 

 

 

 

试剂(C): CCCP(10mM)

10μl

20μl

-20℃

 

 

 

 

试剂(D): ddH2O

45ml

90ml

RT

使用说明书

 

1 份

 

 

 

 

 

 

操作步骤(仅供参考)

1、配制 JC-1 染色工作液:

 

取适量 JC-1 Stain (200×),按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH2O 的比例稀释 JC-1,剧烈 Vortex 充分溶解并混匀 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×),

混匀后即为 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为 1ml,其它培养器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此类推;对于细胞悬液每 0.5~1.0×106 细胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

 

2、设置阳性对照:

推荐 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中,稀释至 10μM,处理细胞20min。随后按照下述方法装载 JC-1,进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞,通常 10μM CCCP 处理 20min 后线粒体的膜电位会*丧失,JC-1 染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经 JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞,CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料确定。

 

3、对于悬浮细胞:

  • 取 1~6×105 细胞,重悬于 0.5ml 细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。

 

  • 加入 0.5ml JC-1 染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。

 

  • 在孵育期间,按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例,配制适量的 JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。

 

  • 37℃孵育结束后, 4℃ 600g 离心 3~4min,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。

 

  • 用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次:加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞,4℃ 600g 离心3~4min,沉淀细胞,弃上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞,4℃ 600g 离心

3~4min,沉淀细胞,弃上清。

 

  • 再用少量 JC-1 Buffer(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

JC-1法检测线粒体膜电位,以及检测线粒体膜电位的操作步骤!

4、对于贴壁细胞:

 

注意:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,应先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

 

  • 吸除 6 孔板培养液,根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入 1ml 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

 

  • 加入 1ml JC-1 染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。

 

  • 在孵育期间,按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例,配制适量的 JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。

 

  • 37℃孵育结束后,吸除上清,用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次。

 

  • 加入 2ml 细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。

 

  • 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

 

5、对于纯化的线粒体:

 

  • 把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1×)稀释 5 倍。

 

  • 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 总蛋白量为 10~100μg 纯化的线粒体。

 

  • 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描,激发波长为 485nm,发射波长为 590nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为 485nm 时,可以在 475~520nm 范围内设置激发波长。另外,也可以参考下面步骤 6

 

 

中的波长设置进行荧光检测。 d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:方法同下面的步骤 6。

 

6、荧光观测和结果分析:

 

检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为 490nm,发射光设置为 530nm;检测 JC-1 聚合物时,可以把激发光设置为 525nm,发射光设置为 590nm。注意:此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在zui大激发波长和zui大发射波长。如使用荧光显微镜观察,检测 JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置,如观察 GFP 或 FITC 时的设置;检测 JC-1 聚合物时可以参考观察其它红色荧光,如碘化丙啶或 Cy3 时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降,并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常。

 

注意事项:

 

1、 JC-1 Stain(200×)应*溶解混匀后使用,但应避免反复冻融。必须先把 JC-1 用 ddH2O 充分溶解混匀后,才可加入 JC-1 Buffer(1×)。不可先配制 JC-1 Buffer(1×)再加入

 

JC-1 Stain(200×),否则导致 JC-1 很难充分溶解,严重影响后续的检测。

 

2、 对于 6 孔板中的样品,本试剂盒共可以检测 100 个样品;对于 12 孔中的样品,本试剂盒共可以检测 200 个样品。

 

3、 装载完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1×)洗涤时,尽量使 JC-1 Buffer(1×)保持 4℃左右,此时的洗涤效果较好。

 

4、 JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在 30min 内完成后续检测,在检测前需冰浴保存。

 

5、 勿把 JC-1 Buffer(5×)全部配制成 1×,因为操作过程中需直接使用 JC-1 Buffer(5×)。6、 如 JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,必须全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在 37℃加热。7、 CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂,有一定毒性,请注意小心防护。

 

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