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WB蛋白印迹蛋白质电泳分离的操作步骤
更新时间:2023-04-06   点击次数:298次
WB蛋白印迹蛋白质电泳分离的操作步骤:


1.样本处理
蛋白质样本首先经过离心(4 ℃,15000 r/min 离心 30 分钟)除去不溶物,再经 SDS 上样缓冲液 100 ℃ 变性 3~5 分钟,使带有强负电荷的 SDS 与带有较弱电荷的蛋白质结合,大量 SDS 可掩盖蛋白质自身的电荷量,只显示 SDS 的负电荷,在 pH8.6~pH8.8 的 Tris-甘氨酸不连续 SDS-PAGE 系统中,蛋白质的泳动与自身电荷量无关,只和其分子大小有关,从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。
电泳样品中总蛋白质浓度不能超过凝胶系统的装载能力,可采用微型电泳系统时,每一个加样孔内的总蛋白量不能大于 5 μg,目的蛋白量在 10 ng 左右较好,蛋白量过高将出现拖尾或蛋白带融合现象。蛋白质样本如经过浓缩,须用合适缓冲液透析除盐后上样,否则在高盐状态下电泳将出现电泳带扭曲的现象。
2.凝胶选择
根据目的蛋白质分子大小选择合适的凝胶浓度,一般情况下,用于免疫印迹的 SDS-PAGE 凝胶浓度与所分离的蛋白质分子量间的关系如表 1 所示。为提高样本分辨率,通常采用高一级凝胶浓度的电泳系统,将获得更好的结果。
表 1 凝胶浓度与蛋白分子量的关系
凝胶浓度
分离蛋白质范围(MW)
8%
>50000
10%
30000~200000
12%
20000~150000
14%
10000~100000
17%
5000~100000
为使电泳后蛋白质从电泳凝胶中转移至固相支持膜上,还须考虑凝胶的浓度及厚度。凝胶的百分含量和交联度越低,转移越容易,最软的凝胶可产生好的转移效率,但凝胶浓度过低可导致电泳带变宽、融合,降低分辨率。凝胶越薄,转移效率也就越高,但过薄的凝胶易碎,导致操作困难。多数情况下采用 0.5~1 mm 厚凝胶,为提高蛋白上样量和检测敏感度,可适当增加凝胶厚度,但不宜超过 2 mm。


3.蛋白质标准品选择蛋白质凝胶电泳需要蛋白质标准品(molecular weight marker)指示系统,来显示电泳的分离效率、转膜效率以及样本泳动情况。SDS-PAGE 凝胶电泳如采用普通蛋白质标准品,须经蛋白质染色后才能确认上述电泳参数,故问题发现不及时,常常导致无效的重复电泳。彩色标准品(rainbow marker)可弥补这一欠缺,如表 2 所示,该 Marker 在电泳凝胶中随蛋白质的迁移,各分子量条带逐渐分开,并显示多种色彩的条带,可直接肉眼观察泳动及分离情况,当目的分子量大小的 Marker 迁移到合适位置(距凝胶底部 1/3 处),同时其与相邻两条 Marker 达到足够分辨距离时,即可停止电泳,取出凝胶。蛋白质样本转膜后的转膜效率和目的蛋白质分子量,均可通过彩色标准品直接推算。

表 2 常用高分子量彩色标准品

标准蛋白质
分子量
颜色
myosin
200000
phosphorylase b
97400
BSA
00069
ovalbumin
46000
carbonic anhydrane
30000
trypsin inhibitor
21500
绿
lysozyme
14300
赤紫
4.SDS-PAGE
1)安装电泳装置和玻璃板。
2)配制分离胶:按照所需浓度和体积依次混合 H2O,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 过硫酸铵,最后加入 TEMED,立即快速混匀。
3)迅速在两玻璃板间隙灌入分离胶溶液,留出沉积胶所需体积和梳子齿长高度。小心地在胶上覆盖一层去离子 H2O,垂直放置于室温中,约 30 分钟使胶凝聚。
4)倒出分离胶上方覆盖液体,尽量吸干。
5)配制 5% 浓缩胶,依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 过硫酸铵,最后加入 TEMED,立即快速混匀。
6)在分离胶上方灌入浓缩胶,并插入梳子,避免气泡!再灌入适量浓缩胶填满梳子齿间缝隙,垂直放置于室温。
7)将蛋白样品加入等量 2X SDS 加样缓冲液,100 ℃ 加热 3 分钟使蛋白变性。2000 r/min,常温离心 3 分钟。
8)取出浓缩胶中梳子,以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。将凝胶装置固定于电泳装置中,在上、下槽均加满 Tris-Glysine 电泳缓冲液。
9)加样 10~20 μl。
10)将电泳装置通电,电压 8V/cm,当染料前沿进入分离胶后,电压提高到 15V/cm,电泳至溴酚蓝到达胶底部,约 2~4 小时。

11)关闭电源,取出玻璃板,撬开玻璃板,小心取出凝胶。


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