抗大鼠胃泌素单克隆抗体的研制

       上海信帆生物科技有限公司为了建立能稳定分泌高亲和力、高特异性抗大鼠胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在对其亲和力、特异性以及生物学功能进行鉴定的基础上,克隆抗大鼠胃泌素单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,构建抗大鼠胃泌素单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行初步鉴定。

       以胃泌素合成肽与钥孔戚血蓝蛋白的偶联物为免疫原,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗大鼠胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,大量制备并经盐析、蛋白G亲和层析获得纯化的单克隆抗体,采用SDS-PAGE对抗体进行分子量和纯度鉴定,间接ELISA法检测效价,双向琼脂扩散实验鉴定类和亚类,非竞争酶免疫实验测定亲和力,斑点ELISA和免疫组化鉴定特异性,并且分别采用荧光染色法和MTT比色法,研究其对胃泌素/胃泌素受体结合的阻断作用,以及对SGC-7901细胞增殖的抑制作用.在此基础上,选择杂交瘤细胞株E8,用TRIZOL试剂提取总RNA,通过RT-PCR,采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物,扩增抗体可变区基因.通过重叠延伸PCR将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来,构建单链抗体基因,克隆到pGEM-T载体中,通过酶切、PCR和测序进行鉴定.然后用限制性内切酶双酶切pGEM-gastrin-ScFv质粒和pET-28a(+)质粒,构建pET-gastrin-ScFv重组表达质粒.转化大肠杆菌BL21(DE3)后,筛选阳性菌株,通过酶切、PCR进行鉴定.阳性菌株经IPTG诱导培养后,分离包涵体,进行变性和复性处理,通过SDS-PAGE和竞争抑制ELISA对表达蛋白的分子量和活性进行初步鉴定.