1、初始步骤：这是热启动PCR所必需的。将反应混合物加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步骤的时间取决于所选择的DNA聚合酶。
2、变性步骤：DNA本身是双链结构，DNA扩增需要引物和单链DNA模板的结合。在该步骤中，将反应混合物加热至94-98℃20-30秒，以断开双链之间的氢键，从而释放单链DNA。这是PCR周期的第一步。
3、退火步骤：变性后，DNA模板以单链形式存在于反应混合物中。由于反应系统中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补序列形成氢键。
4、延伸步骤：在该步骤中，DNA聚合酶开始DNA合成，因此该步骤的温度是DNA聚合酶的最佳温度。我们通常选择72度，但某些DNA聚合酶的最佳温度是68度。这一步骤与体内DNA复制非常相似：DNA聚合酶根据碱基互补的规则将dNTPs添加到引物的3'端，最终获得新的DNA双链片段。
5、步骤2至4被称为一个周期：每个周期后的DNA量是前一个周期的两倍。通常，PCR反应需要30-35个周期。在前几轮PCR循环中，PCR产物的数量以指数速率增加，但在反应后期，随着dNTPs和引物数量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐降低，因此PCR反应的产率也受到限制。
6、最终延伸步骤：在30-35个循环后，我们通常在68-74度下延伸5-10分钟，希望完成反应系统中剩余的所有单链DNA的反应。
更新时间：2022-11-24 
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