植物超氧阴离子染色液(NBT法)的使用方法

植物超氧阴离子染色液(NBT法)的使用方法

植物组织在胁迫环境条件下会产生多种活性氧（ROS），ROS活性非常大且极其不稳定，因此ROS的检测通常因其最终产物而定。超氧阴离子是活性氧的一种，属于一种含氧自由基，能将NBT（氮蓝四唑）还原成不溶于水的蓝色甲瓒化合物，从而定位组织中的超氧阴离子。根据基本原理也称其为NBT法。本产品就是基于以上原理，用于植物活组织中的超氧阴离子染色。一般应用于较嫩的根尖、叶片等的整体染色，染色后有超氧阴离子聚集的部位呈蓝色至深蓝色。

使用方法

1. 试剂准备：将50 mg NBT以Tris缓冲液(pH 7.4) 100 mL充分溶解，得到NBT染色工作液，避光4℃保存，一周内有效。

2. 采集植物幼苗或根尖，纯水稍洗净，滤纸上吸干多余水分。将植物幼苗或根尖浸入NBT染色工作液中，常温避光浸染2-6 h，至阳性部位出现深蓝色，其余部位为淡蓝色或近无色或呈植物本身的颜色即可（根据植物幼嫩程度。显色程度调整染色时间）。

3. 用镊子将植物幼苗或者叶片小心取出，纯水漂洗3-5次，置于滤纸上吸干多余水分后，浸入95%乙醇中40℃处理3-16 h，目的是脱去植株幼苗或者叶片本身的叶绿素或者淡蓝色背景，处理期间可多次更换新鲜的95%乙醇。

4. 用镊子取出植株幼苗或者叶片，浸入纯水中来回漂洗3-5次，置于滤纸上吸干多余水分后，将样本转入适量NBT样本保存液中浸泡30 min后，随后可取出拍照。样本可置于该溶液中常温保存一周。

注意事项

1. NBT染色工作液配制好以后需4℃避光保存，一周内使用。存放时间过久，会影响显色。

2. 因任何外在因素都可能刺激植物应激产生超氧阴离子，因此植物样本需要新鲜采集，并尽快完成染色。建议做阴性及阳性空白对照组。

3. 样本染色完成后尽快拍照保存结果。

4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。

植物超氧阴离子染色液(NBT法)的使用方法