基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳试剂盒(MMP2/9)操作说明

1. 简介：
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在研究诊断和治疗中的意义日益受到重视。
 
2. 检测原理：
本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一种广为使用的、基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度~1nM。试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。
 
3. 检测目的:
本试剂盒用于检测MMP-2、MMP-9 酶谱及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。
 
4.  试剂盒组成与储存：
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC；
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释；
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释；
E. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºC。
 
5.检测步骤：
5.1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
5.2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。
阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。
注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，好的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照
5.3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
5.4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。
5.6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。
透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
5.7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中常见的格式。
6.说明：
1. 10 mM 能够EDTA*抑制MMP活性。
2. 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置室温快速干燥凝胶，作为记录保留。
 

基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒(MMP2/9)操作说明

7.参考文献：
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202
 
SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书
常规考马斯亮蓝SDS-PAGE 凝胶蛋白质染色是实验室常用的凝胶染色方法。银染方法虽然灵敏度高，但所需试剂复杂并且有毒有害，操作步骤繁琐，难以控制获得好的染色效果。
 
染色步骤：
1. 此染色液即为工作液，使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝
胶，并缓慢摇动2h；
2. 倾去染色液，用脱色液冲洗凝胶；
3. 以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2h，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的蓝色的条带和干净的背景（通常此过程需要2～4h，也可脱色过夜至清晰的蓝色的条带和干净的背景）；
4. 对凝胶进行分析和照相，凝胶可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置（P2000）对
凝胶进行处理后保存。
安全性：含有甲醇，无特殊毒性，按一般化学品操作规程处理。
说明：
1. 染色液配方：0.25g 考马斯亮蓝R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合1h 后用
Whatman 1 号滤纸过滤，于室温可无限期保存；
2. 脱色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 保存液：7％冰醋酸；
4. 凝胶染色之后，染色液可以回收利用，装入新容器内，室温或4 ºC 保存，可反复使用2-4 次。

基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳试剂盒(MMP2/9)操作说明