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ELISA试剂盒基本原理介绍(初级)
更新时间:2018-08-21   点击次数:2345次

ELISA试剂盒基本原理介绍(初级)

实验原理

    用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中的氧化作用使颜色加深,无法准确地定量。

     辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的zui大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的zui大吸收峰是275nm,所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右,zui高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

 

ELISA的基本原理有三条:

    (1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;
    (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;
    (3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。

    ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于研究标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

 

基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过一夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
  2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
  3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
  4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
  5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
  6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

 

基本方法二 用于检测未知抗体的间接法:
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过一夜。次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

 

(二)酶与底物

    酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物 

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