明胶酶谱法试剂盒实验步骤解析
更新时间：2017-06-21 点击次数：900次
明胶酶谱法试剂盒实验步骤解析
明胶酶谱法，首先是将样品进行电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中，将样品中的MMP-2和MMP-9复性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，zui后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
明胶酶谱法试剂盒实验步骤：
1.取对数生长期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24小时。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞上清液中的蛋白浓度。与5×上样缓冲液混合，16ul样本+4ul上样缓冲液。
4.配制分离胶和浓缩胶，20ul/孔上样，4℃进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次,每次30分钟,然后用漂洗液漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液中37℃孵育42h。
6.孵育结束后经染色液染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP-9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
明胶酶谱法试剂盒注意事项：
1、明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
2、孵育液的PH在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
