ELISA试剂盒常见问题的原因分析和处理方法（2）

　3操作技术 
　　操作过程的控制：①严格按照试剂说明操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60 min。②加样后及时放入孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗*。③封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“盎”灞的出现。④用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象。⑤合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。⑥加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。⑦显色剂尽量在临用前配制，不使用过期显色剂，肉眼可见浅蓝的TM显色剂不用。⑧加样时保持显色剂不外流；A、B液应避免接触金属器械。加终止液时要避免产生气泡。⑨应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以得到更准确、更可靠的实验结果。加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。 
　　温浴影响。在建立ELISA方法时做反应动力学研究。实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1～2 h，产物的生成可达。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。反应板孔、反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。温育的温度和时间应严格按规定控制，特别要注意边缘位置。96孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周边孔与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。 
　　洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELISA应是靠洗涤来达到分离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固体相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是zui主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎随意。

　　洗涤液多为含非离子性洗涤剂中的中性缓冲液，各种试剂盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，又含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质恢复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度为0.005%～0.02%，高于0.02%可使包被在固相上的抗原或抗体借吸附而减低试验的灵敏度。洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5 μs/cm，洗液如果结晶应待其溶解后配制。手洗条件一致性较差，对结果影响较大。半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果，血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标记酶洗脱不*，导致“花板”，造成假阳性或假阴性。所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。 
　　保证洗板浸泡时间为40 s左右，孔内液体被洗板机洗得越干净越好。 
　　4显色和比色 
　　TMB经HRP作用后，约40 min显色达，随即逐渐减弱，至2 h后即可*消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮纳和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12～14 h）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变为橙黄色，此时可用特定的波长（450 nm）测读吸光值。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、线性等。优良的酶标仪的读数一般可到0.001，使用前先预热仪器15～30 min，测读结果更稳定。 
　　测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，*次在zui适波长（W1），第二在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置，zui终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 
　　肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。 
　　5 HOOK效应 
　　随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HOOK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减少HOOK反应的发生。 
　　6干扰物质 
　　有人认为大约40%的科研血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医原性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其他物质等。如RF因子可与标记二抗的Fc段结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃ 30 min灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇）在储存过程中可能形成二聚体，会导致本底过深，影响检测结果。 
　　7药物的影响 
　　价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现。如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播，在孕第8、9、10月常规注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出，而且其所生的新生儿常出现HBsAg阴性、HBeAg阳性和HBcAb阳性等少见模式，可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体与通过胎盘进入胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物，则新生儿HBsAg检测呈阴性，用0.5 mol的盐酸处理标本1 h可提高检出率。 
　　为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成分，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能够把它检出，如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应做HBsAg检测。 
　　8 抗原自身因素 
　　融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响以丙肝诊断试剂盒为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。 
　　少数HBV感染后外周血中不含HBsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg，含量为5 μg/ml～600 μg/ml。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg携带者zui低含量为0.2 ng/ml，含量高者可达2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。zui近，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58～118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。 
　　总之，的试剂、状态良好的仪器、排除各种影响因素的干扰和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。