基质金属蛋白酶(mmp2/9)试剂盒的检测步骤介绍
更新时间：2022-08-27 点击次数：1078次
1、制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10×substrateG并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
2、待测样品：切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker即可。
3、低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4、洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml1×BufferA(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2×30分钟。中间换液。
5、孵育：加入10ml1×BufferB(蒸馏水稀释)，室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过一夜。
6、显色：倒掉BufferB，加入凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。
7、条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色.MMP条带则为白色。
