明胶酶谱试剂盒操作步骤

明胶酶谱试剂盒操作步骤

1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。

阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。

注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，好的方法是将全血中白蛋白进行分离做阳性对照

3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer

A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 18小时。中间换液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。

透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中常见的格式。

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