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免疫组化（IHC）的原理是，根据抗体与抗原的特异结合来检测组织切片中的抗原（如蛋白）。词根immuno是指操作中所使用的抗体，而histo代表着组织。

利用特异的肿瘤标志物，医生们可以通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性，确定肿瘤的分期和分级，鉴别细胞类型和转移的来源。IHC也能用于药物开发，研究者们通过检测靶点的上调或下调来判断药物的疗效。

商业化的IHC抗体一般都提供有稀释和染色的建议，能为你节省许多摸索过程。然而，事情往往没那么简单。你的抗体可能没在IHC中验证过，或者你的样本并不标准，又或者实验就是不像文献或演示视频那样顺利，这时我们该怎么办呢？

“IHC不只与一抗有关，还有缓冲液、抗原修复液和酶，”纽约大学Langone医学中心的IHC主管Luis Chiriboga说，“这些都是重要的变量。”平衡这些变量是一件相当繁琐事，而本文介绍的一些小窍门可以帮你简化这一过程。

首先要有信号

Chiriboga在教学生做IHC时总会说，生成信号是*要务。“你必须先看到信号，才知道接下来要怎么做。” 一开始他通常使用较高的抗体浓度，在抗原表达水平不同的组织中进行测试，以便获得一个动态范围。

不过，调整信号就不只是抗体的问题了。“高品质抗体是*要素。但如果用错了其它试剂，好抗体也会失败，”CST公司的Katherine Crosby说。

缓冲系统对一抗结合抗原的能力有着深远的影响。如果你用了抗体供应商推荐的试剂和方案但却没有看到理想的结果，就应该及时供应商的。如果你用的是经未测试的抗体，就有必要对pH或离子强度进行调节。

如果实验仍然检测不到组织里的抗原，但该抗原的确有表达，那么可能是抗原表位在固定过程中出了问题（比如被掩盖或变性）。在这种情况下，我们就需要对抗原进行修复。目前的抗原修复基本上是酶处理（比如pronase或trypsin）或者某种形式的加热，Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson说。

另外，我们还可以尝试不同的固定剂，用乙醇、甲醇甚至丙酮来取代福尔马林。“这些试剂会使抗原表位产生不同的改变，”Stephenson指出。

更好的标记体系

一般情况下，抗原识别只是整个过程的一部分。经典IHC方案是用二抗来识别一抗。二抗可以与辣根过氧化物酶（HRP）直接相连，不过更多情况是先用二抗连接生物素，然后用连有酶的链霉亲和素来进行识别。这样能形成一个多层次的信号放大系统。

“不过，这样的系统也可能带来更多的误差和背景，”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin说。举例来说，亲和素可能识别内源生物素，尤其是在肝脏和肾脏这样的组织。（延伸阅读：攻克多重PCR之难）

为此，许多研究者放弃了偶联生物素的二抗，开始使用一种以聚合物为基础的试剂。“它们相当于拖着一长串酶的二抗，”Vector Laboratories公司的Craig Pow说，该公司致力于生物试剂蛋白标记和检测试剂。“这显然比使用HRP二抗要灵敏得多。”

据Pow介绍，这种试剂的敏感度与生物素/亲和素差不多，但使用起来要简单得多，而且不用担心内源生物素产生的背景。如果需要更高的敏感度，还可以采用基于多级聚合物的试剂，比如Vector Laboratorieszui近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit。

与酶体系相比，荧光体系能够更的定位抗体，甚至可以同时成像两个核抗原。不过，荧光成像的黑色背景不能提供常规显微镜那样的形态学结构。Sigma Aldrich公司的Duolink®系统有足够的敏感性和特异性，可以通过两个一抗检测邻近的抗原表位。

选择合适的颜色

IHC中zui常用的酶是HRP和碱性磷酸酶（AP），不过它们的效果并非*相同。HRP体系倾向于生成更密集的信号，“与AP相比能提供更细小更清晰的定位，”Pow说。但这并不是说AP就比HRP差，“实际上在某些应用中，正因为AP不那么稠密，反而能展现出更好的形态。”

这两种酶都有不同的生色底物，可以产生不同颜色的产物。“我们应当选择合适的颜色和复染剂，”Crosby说。

IHC远远不是把抗体放在组织切片上，然后用显微镜观察那么简单。要想得到实用、可靠而且清晰的结果，就需要耐心的对每一步进行优化。

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