小鼠ELISA试剂盒研究：长读取测序揭秘转录本结构

短读取的 RNA-seq 虽然可以计数已表达的转录本，但无法提供这些转录本的结构信息。

现在，斯坦福大学研究人员在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上报告称，他们开发出了一种能保留转录本结构信息的新方法，他们通过环状 cDNA 模板和长读取测序，实现了对转录异构体（transcript isoform）的定量和分析。

在这项研究中，科学家舍弃了传统的短读取 RNA 测序法，利用 PacBio 公司提供的长读取技术来测序完整的转录本。他们在 20 个人体组织的混合样本中，鉴定得到了 476,000 个转录本序列，平均长度 1 kb。

绝大多数哺乳动物的基因，不符合一基因一转录本的模式。这些基因往往存在多种剪切形式，拥有可变的转录起始/终止位点。短读取的测序技术不能提供上述信息，举例来说，短读取可以检测到发生选择性剪切的外显子，但无法判断外显子之间的结构关系，是包含在同一个转录本中还是各自独立出现。

理论上，长读取测序技术可以克服这样的限制。研究人员构建了由环状cDNA模板组成的SMRTbell文库，并将其用于测序。由于测序平台的读取长度实际上比这些 cDNA 长，该系统可以对每个碱基读取多次，沿着圆环不断进行，生成更为的“环化一致序列”（circular-consensus sequence CCS）。在这项研究中，平均读取长度达到 7 kb，绝大多数 cDNA 碱基被测序了 5-15 次。

研究人员鉴定得到的绝大多数是全长转录本，但也并不*。这是由于 PacBio 测序读长和 cDNA 合成效率的限制，而这两个因素都受序列长度的影响。

论文的主要作者 Michael Snyder 表示：““对 1.5 kb 以下的 cDNA 来说没什么问题，对于大部分2-2.5 kb的cDNA来说，也可以鉴定到全长，”作者写道。“更长的转录本需要参考，质量较低但更长的读取数据。”总的来说，研究人员获得了 476,000 个CCS，代表着 476 million 碱基。

研究人员将这些转录本，与 GENCODE 项目鉴定的 mRNA 进行比对，确定了约 14,000 个全长的转录异构体（包括编码和非编码的转录本），其中有10%是前所未见的。Snyder 表示：“这类研究就好比是盲人摸象，而我们看到了更完整的图像。”

这项研究中的方法可以用于 RNA 的结构分析和定量。不过，西班牙科学家 Roderic Guigo （未参与该研究）认为，单纯从实用性和经济性考虑，这一方法主要适用于前者，因为在真实样本中为各转录异构体计数是很昂贵的。

麻省理工学院的 Chris Burge 教授（未参与该研究）评价道：“该方法有望在转录异构体水平全面注释基因组，揭示转录本的详细结构信息。”

这项研究可以帮助人们解决一些转录本难题，例如判断相距较远的选择性外显子剪切是否相互关联。不过 Burge 也指出，许多人类转录本实际上超过 2 kb，这一技术还有待进一步改进，以处理更长序列。