间接 竞争 ELISA试剂盒 检测TGEV方法的建立

      研究用经Ni2+-NTA金属螯合层析柱纯化后获得纯化的重组N蛋白作为抗原检测试剂,抗重组N蛋白的单克隆抗体作为抗体诊断试剂,用非离子去污剂暴露出TGEV的核衣壳蛋白,利用竞争原理针对粪便中的TGEV建立了一种快速的间接竞争ELISA检测方法。并对方法中封闭液的选择及工作条件进行了确定,结果表明0.5%聚乙烯醇在37℃封闭2h效果。该方法对感染TGEV的20头份仔猪的粪便样品进行检测,并用统计学方法对仔猪粪便样品的检测数据进行了分析,确定了阳性值判定标准为:在阴性对照（N）OD492nm>0.9情况下,抑制率大于14.5%为阳性。特异性实验结果表明,建立的间接竞争ELISA对猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道病毒的检测均为阴性反应。 以TGEV TH-98株的强毒株人工服感染未进初乳的初生仔猪,24h后收集仔猪粪便样品,用间接竞争ELISA和RT-PCR方法分别对粪便进行病原体检测,结果表明,在仔猪感染62h以后,用间接竞争ELISA方法可检测到在肠道内扩增的TGEV;RT-PCR方法在感染后57h即可检测到TGEV。RT-PCR方法比间接竞争ELISA要早近5h检测到TGEV。对63h以后的粪便作10倍稀释时,间接竞争ELISA方法可检测到粪便中的TGEV,而RT-PCR方法对粪便作20倍、40倍稀释时,仍可检出TGEV。表明RT-PCR方法较间接竞争ELISA方法敏感。