ELISA检测技术对于BT抗虫基因植物的研究

     农业是国家的基础。农业当中不可避免的就是虫害的问题。接下来，我们就讨论一下ELISA试剂盒检测技术对抗虫基因植物的研究。
    眼下应用得和zui有潜力的一个抗虫基因是Bt杀虫基因，在农业虫害的防治过程中起到非常重要的作用。虽然现在获得的转Bt抗虫基因植物已达近70种，但是新的Bt杀虫基因仍然不断的被分离和鉴定，使得转Bt抗虫基因植物的研究持续、高速发展，因此急需找到一种快速、简便、准确的检测方法。

    此ELISA研究实验以目前抗虫转基因育种中研究zui多的Bt CryIA（C）基因的表达产物为检测目标，在提取出高纯度抗原并制备出高特异性抗体的基础上，系统研究了两种载体上三种ELISA试剂盒测定方法的检测灵敏度，初步建立起快速、准确的ELISA检测技术。研究结果如下：

 一．采用多种生化技术提取苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，制备出了高纯度的抗原。首先用碱液（50mM Na_2CO_3，50mM EDTA，3％巯基乙醇）裂解孢晶混合物，调节PH至等电点沉淀出晶体杀虫蛋白，再用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳进一步纯化粗提的杀虫晶体蛋白，经SDS-PAGE电泳分析显示只有一条带，说明获得的分子量约为130KD的杀虫晶体蛋白达到了电泳纯，为制备特异性抗体提供了条件保障。
 二．制备出了高特异性的Bt杀虫蛋白抗体和高质量的酶标抗体。用纯化的Bt杀虫蛋白作为抗原免疫白兔，获得了高特异性的抗血清，再经过硫酸铵沉淀和DEAE-52柱层析纯化，提取出了较纯的IgG。采用改良的过碘酸钠法，用辣根过氧化物酶标记IgG制备出了克分子比为2、工作浓度为1：800的高质量酶标抗体。为建立高灵敏度的酶联免疫检测方法奠定了基础。

三．比较了两种载体上三种ELISA试剂盒检测方法的灵敏度，初步建立起检测Bt杀虫蛋白的高灵敏度方法。在聚苯乙烯酶标板上的测定结果表明：直接ELISA和夹心ELISA的灵敏度相同，都为0.94ng／孔，但直接ELISA检测中抗原浓度与OD值间的线性关系呈极显著，夹心ELISA中抗原浓度与OD值间的线性关系呈显著；间接ELISA的灵敏度较前两者低，使用HRP-IgG的灵敏度为15ng／孔，抗原浓度与OD值间的线性关系呈显著，使用AKP-IgG的灵敏度为3.75ng／孔，抗原浓度与OD值间的线性关系呈极显著。在硝酸纤维素膜上的测定结果表明：直接Dot—ELISA和夹心Dot-ELISA的灵敏度相同，都为4.06-8.13ng，间接Dot-ELISA的灵敏度较前两者高，使用HRP-IgG的灵敏度为2.03-4.06ng，使用AKP-IgG的灵敏度为2.03ng。