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明胶酶谱法电泳试剂盒
更新时间:2018-10-09   点击次数:1300次

明胶酶谱法电泳试剂盒


1. 简介:
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌,活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白,又称胶原酶。通过影响细胞外基质,胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程,并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程,其在研究诊断和治疗中的意义日益受到重视。
 
2. 检测原理:
本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一种广为使用的、基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法,其灵敏度可达1 nM,高于ELISA方法,其基本原理和程序是:制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳,电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer 孵育,凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮区域,从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液,可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性,检测灵敏度~1nM。试剂盒可进行50次标准小胶检测,如果小胶加样孔为10~15个,则总计可检测500~750个样品。
 
3. 检测目的:
本试剂盒用于检测MMP-2、MMP-9 酶谱及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM)。
 
4.  试剂盒组成与储存:
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC;
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC;
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;
E. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºC。
 
5.检测步骤
5.1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化,并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。
5.2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染Marker 即可。
阳性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合,取5-15μl 上样。
注:因为全血成分复杂,MMP活性较低,好的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照
5.3 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
5.4 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5.5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。
5.6 显色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。
透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
5.7 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中常见的格式。

注意事项:
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
2.明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
6.明胶要4度保存,配好后1周内使用

凝胶制备:
1.玻璃板对齐后放入夹中,垂直卡紧,加满水检漏。
2.配10%分离胶,APS和TEMED作用为促凝,后灌胶前加。若板不漏水,则将水倒出,并用吸水纸洗净后灌胶,灌至大约3/4处,上面加满水压平。
3.配浓缩胶,同样地,APS和TEMED后加,分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝,同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线,说明胶已凝固。
4.将上面的水倒去,吸水纸洗净,灌入浓缩胶,灌满,注意一定不要有气泡,然后将梳子插入,注意保持水平,约30min后凝固可用。
5.拔梳子在电泳缓冲液中拔,加样孔用小针筒冲洗干净再上样,注意上样时勿使样品逸至邻孔,样品混匀时要轻,不要产生气泡,否则加样时易导致逸出而使结果不准确。

明胶酶谱法电泳试剂盒