PCR实验代测准备工作
更新时间：2018-06-25 点击次数：1092次
PCR实验代测准备工作
PCR实验代测有三步：抽提RNA，RT，PCR。
试验前注意：
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
实验器具的处理与准备：
1、塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)。
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干)。
3、匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC
试验试剂：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。
3、异丙醇：放入棕色瓶中。
4、lu仿：放入棕色瓶中。
5、琼脂糖
注意事项：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
4、在所有RNA实验中，关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
5、做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
6、RT按要求做，一般不会出太大问题。
7、PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
8、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：lu仿、溴化乙锭(EB)、酚、异硫氰酸胍、紫外线等
