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信帆生物推出:ELISA试剂盒HRP的制备方法
更新时间:2017-02-23   点击次数:1596次

信帆生物推出:ELISA试剂盒HRP的制备方法

1).水提取:称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在绞肉机中绞碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次,合并2次滤液,测得总体积。

2).硫酸铵分级分离:在不断搅拌下,每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度,0℃),大约在1~2h内加完,置冷室中放置过一夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面混浊液以3 000r/min离心15min,弃沉淀,合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过一夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/min离心20min,弃去上清液,收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析,中间更换2~3次,用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并,在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min,弃去沉淀,量上清液的体积。

信帆生物推出:ELISA试剂盒HRP的制备方法

3).丙酮分级分离:将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4000r/min离心15min,弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。

4).精制:将上步酶液适当稀释,滴加1mol/L硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L,5 000r/min离心10min,得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离心,洗液与清液合并,分装于透析袋内,用水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行真空冰冻干燥(约得20mg),产品呈米黄色纤维状松软物,HRP产品的RZ值可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。

(1)戊二醛二步法)

1) 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2)标记步骤:

(1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过一夜

(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。

(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时。)

(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。

(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。

(7) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

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