新品上市：猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒

猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒

（此说明书仅供参考，以包装内英文说明书为准！！）

1、疾病概况

PEDV属于冠状病毒科，可以使任何年龄段的猪出现严重的小肠炎，初生仔猪容易死亡。这个病的症状与TGEV相似。

在欧洲和中国已受该病的传播影响。1969年在欧洲爆发过此病毒的大流行。在1969年前，收集的猪血清中没有出现相应的抗体。从那时开始，该病已向欧洲多个国家蔓延，严重的爆发则较少发生。在大型的养殖场里，病毒持续留在断奶和失去母源抗体免疫力的仔猪体内。在这些场里，病毒可能与断奶腹泻有关。病毒的传播主要通过猪的直接接触传染和接触病毒污染物的间接传染。

PED的研究症状包括厌食、呕吐、腹泻和脱水。在5日龄以下的感染猪由于发生严重的腹泻和脱水，发病率和死亡率为100%；而大于10日龄的染病猪的发病率和死亡率为10%。

该病肉眼可见的病变是小肠边缘的绒毛变短作为主要特征，与TGE的病变相似。结肠无病变。

2、试剂盒的介绍

从生物试剂母猪的初乳中检测PED IgA抗体的试验，对PED的防控有很大的意义。韩国安捷公司的PED IgA抗体ELISA试剂盒含有已经包被好PED IgA抗原的微孔酶标板。检测时，包被抗原的酶标板与稀释好的血清孵育，然后与羊抗猪的IgA-HRP酶标物反应。孵育后，在加入底物前用清洗液将没有结合的物质清洗干净。反应结合的酶跟孔中乳汁的PED IgA抗体的量成正比例。加入终止液结束反应，用酶标仪在456nm和620nm双波长条件下，读取结果。

3、试剂盒组成

1）抗原包被好的酶标板5块

2）阴性对照：1ml1瓶

3）阳性对照：1ml1瓶

4）样品稀释液：80ml1瓶

5）20倍浓缩的清洗液：250ml1瓶

6）101倍浓缩的酶标物：1ml1瓶

7）酶标稀释液：80ml1瓶

8）底物A：40ml1瓶

9）底物B：40ml1瓶

10）终止液：80ml1瓶

11）封板膜10块

12）说明书1份

4、注意事项

为了得到重复性好的结果，建议必须遵循以下规定。

1）只用于体外诊断。

2）不同批号的试剂不能混合。

3）使用干净的玻璃器皿，不准使用生锈的金属容器。

4）接触潜在感染物和实验操作时，必须使用一次性手套。

5）使用底物和终止液时要小心，避免让液体接触皮肤、眼睛和粘膜。如果不慎沾上，应立即用自来水冲洗。

5、样品收集和保存

1）从生物试剂的母猪身上采集乳汁样本。

2）如果样本不是马上进行检测的，请保存在2~8℃的环境中。要保存时间超过3天的，请将样品保存在-20℃或更低的温度环境中。使用前，请把样品放到室温环境进行回温。

3）出现沉淀物的样品会使结果不一致，该样品不能进行实验.

6、试剂的准备

1）使用前，将试剂盒的所有试剂回复到室温。

2）不用稀释阴、阳性对照液和样品。

3）准备酶标物（101倍浓缩）：使用前，必须将酶标物按1:100进行稀释。（10ul的酶标物加入1ml的酶标物稀释液中进行稀释。）

4）清洗液的准备（20倍浓缩）：使用前，必须将清洗液按1:19进行稀释。如果洗液出现结晶物，请将洗液放在37℃处，加热数分钟即可溶解结晶物。（10ml清洗液加入190ml的纯净水中进行稀释。）

5）底物的准备：使用前，将底物A和底物B按1:1混合。为了得到更好的检测结果，在使用前，底物溶液要达到20~25℃，或培养30分钟。

7、操作步骤

1）准备好用于样品稀释的酶标板。在每个微孔中加入100ul的样品稀释液。

2）阴、阳性对照液个2个孔，其余各孔为样品孔。

加入10ul的阴性对照液于A1和B1孔

加入10ul的阳性对照液于C1和D1孔

其余各孔加入10ul样品

3）用封板膜把反应孔盖好，然后轻轻地振荡酶标板。此步骤对实验结果的重复性是很重要的。

4）在37℃下，孵育60分钟。

5）用已稀释好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要将板里的水扣干净。

6）每孔加入100ul酶标物。

7）在37℃下，孵育30分钟。

8）用已稀释好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要将板里的水扣干净。

9）每孔加入100ul底物。

10）18～25℃下，孵育15分钟。

11）每孔加入100ul终止液终止反应。

12）用酶标仪，在450nm和620nm双波长的条件下，读取吸光值。必须在30分钟内，完成读取结果。读取结果时，酶标板内不能出现气泡。

8、检测分析

1）检测的有效性

①　阴性对照的平均OD值<0.200

②　阳性对照的平均OD值>0.500

③　如果上述其中一个值超出了规定的范围，则该实验被视为无效。所检的样品需要重新进行检测。

2）计算判断值

①　用A1和B1孔的吸光值来计算阴性对照的平均OD值。

判断值＝（0.35＋阴性对照的平均OD值）

②　根据阴性对照的OD值，样品结果的判断标准如下：

-阳性结果：样品OD值>判断值

-阴性结果：样品OD值<判断值

③　举例：

阴性对照平均OD值：0.078

判断值＝0.35＋0.078＝0.428

样品OD值为0.389：样品为阴性

样品OD值为0.894：样品为阳性

9、局限性和干扰性

1）检测步骤，注意事项和对结果的判定必须严格按照说明书进行。

2）采样：

①　样品中所含有的*，对测试结果没有影响。

②　巴氏灭菌法（60℃条件下不少于10小时）消毒过的样品可能导致活性减弱，故而不可用于检测。

③　加热灭活的样品（56℃，30分钟）并不影响试验结果。

④　抗凝血剂如肝素，EDTA，柠檬酸盐不会影响试验结果。

⑤　溶血的样品应在使用前离心，以免被细胞内成分干扰。

⑥　含有脂肪酶或黄疸的样品并不影响检测结果。

3）操作规程中样品加入失败，将会引起错误的结果，如有研究上有任何疑似PRRS病毒感染症状，建议重复检验。

10、保存条件

所有试剂都要保存在2～8℃的环境中。

11、稳定性

1）不要使用过期的试剂盒

2）准备的试剂的稳定性