Trizol,RNA提取试剂盒现货热卖，欢迎联系

Trizol,RNA提取试剂盒现货热卖，欢迎

Trizol 使用说明书
描述：TRIzol 是一种快速从组织细胞中提取总RNA 的单相试剂。在样品裂解过程中TRIzol 能够抑制RNA 酶
活性保持RNA 完整性；加入氯仿后离心，RNA 相将与DNA 和蛋白质分离，随后用异丙醇沉淀RNA。如果需要
还可以继续提取DNA 和蛋白质。纯化的总RNA 可用于RT－PCR、Northern Blot、RNA 酶保护、Poly(A) mRNA
纯化、体外翻译等实验。
储存: 4 oC 密封避光保存两年有效。
适用: (1) 固体组织(100 mg /ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。
(2) 培养细胞(5~10 x 106 细胞/ml): 真核细胞，细菌，酵母。
(3) 液体标本(100 μl/ml): 全血、体液、尿液，病毒样品等。
操作准备：
极微量的RNA 酶都会导致RNA 降解。分离RNA 时RNA 酶污染主要来自以下五个方面：(1) 实验人员的双手。
(2) 器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放的内源RNA 酶。(4) RNA 未能*与
蛋白质分离。(5) RNA 沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。Trizol 可抑制RNA 酶活性, 因此在有Trizol
存在的步骤中，使用高压消毒20 分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA 提取操作。然而在RNA 溶解之后，
来自实验材料的RNA 酶污染将会导致RNA 降解，应严格使用高压灭活RNA 酶的用品。戴手套无疑是有益的，
但戴口罩和帽子则无必要。
1. 固体组织破碎设备。准备下列装置之一，1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁，用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。
2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨，清洗方法同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装
满蒸馏水的试管或烧杯中，开启超声清洗探头30 秒至1 分钟。4)高速机械匀浆器(Polytron，Tekmar
或类似产品)。打开开关，在蒸馏水中清洗分散器头数次。
2. 高压蒸汽30 分钟消毒一次性吸头离心管。RNA 沉淀和溶解之后，应严格使用高压消毒的一次性用品。
由于不可预测的原因，如：动物已经处死，组织已取出，细胞已收取，而吸头和离心管尚未高压处理。
此时保险做法是使用普利莱基因技术公司的另种产品――组织RNA 保护液(Cat# R1030)，用户可把来不
及处理的标本保存在RNA 保护液中，37 oC 保存3 天，25 oC 保存2 周，4 oC 保存4 周，－20 oC 保存数
月，固体或液体标本中RNA 不会降解。
3. DEPC 处理的双蒸水。加DEPC 到水中至终浓度为0.01% v/v，室温过一夜，高压消毒30 分钟。用于溶解
RNA，配制TE 缓冲液和75％乙醇。
4. 普通双蒸水。高压消毒30 分钟，用于冲洗器皿，配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高
压灭菌，但琼脂糖不能高压处理。
5. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA 降解。
6. 异丙醇，氯仿，纯乙醇，分析纯。75％乙醇用高压消毒的蒸馏水配制。
7. 其它用品。电泳槽，双蒸水冲洗。离心机和加样器，无需处理。
8. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA 使用大量RNA 酶，为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。
RNA 提取程序：
1. 组织细胞破碎与裂解
冰上操作快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使RNA 得率下降，还将导致DNA 和蛋白质污染。
(1) 固体组织。按比例每50-100 mg 组织加1 ml Trizol 试剂。用研钵研磨：仅适用于液氮冻存组织。
组织放在研钵中研成粉末，加1 ml Trizol 试剂，继续研磨至组织*裂解。用玻璃匀浆器匀浆：加入Trizol
上下手动匀浆组织10-15 次。用高速机械匀浆器：将组织放入塑料试管内，试管置冰浴烧杯中，加入Trizol
试剂，将分散器头垂直插入管内与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，上下移动试管10-20 次，直到组
织*打散，无肉眼可见大块。用超声仪：根据机器型号进行预试验，选取能有效破碎组织的功率和时间。
注意：(1)由于Trizol 的性能，通常用50-100 mg 组织可获得足量的RNA，对绝大多数实验目的绰绰有
余。加入过量组织或过少Trizol 容易导致提取失败。(2)少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA 提取。(3)
用研钵和玻璃匀浆器匀浆破碎组织时，应略微多加一些裂解液，以补充裂解产物粘在容器壁上造成的体积丢
失。
(2) 培养细胞。贴壁细胞：弃培养基，用PBS 缓冲液冲洗细胞一次。每5-10?106 个细胞加1 ml Trizol
试剂，但Trizol 加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个75 cm2 瓶皿的细胞通常需要2 ml 提取液，
一个35 cm2 瓶皿的细胞需要1 ml 提取液，更小的培养瓶皿可使用更少的提取液，但后续操作会因体积过小
而极为不便。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上5 分钟，倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚
于一处以便取出。悬浮细胞：低速离心收集细胞，将细胞快速重悬于50-100?l 的PBS 或去离子水中，每
5-10?106 细胞加1 ml Trizol 裂解。注意直接裂解未重悬的细胞沉淀，裂解物将十分粘稠而难以分散。细菌
酵母：离心收集沉淀，加入50-100?l 去离子水重悬细胞。每107 细胞加入1-2 ml Trizol 直接裂解。某些
细菌和酵母细胞可能需要匀浆破碎。
Page 2 of 2
(3) 液体标本：如体液、尿液、全血。每100?l 液体样品加1 ml Trizol，置冰上1-3 分钟。未抗凝
的凝固血液按固体组织处理。Trizol Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本RNA 提取。
2. 将组织细胞裂解物转移到1.5 ml 离心管，置冰上10 分钟。
优化步骤：如果组织裂解物含较多的碎片，或提取植物组织，12,000g 4 oC 离心10 分钟，取上层裂解液，
弃管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪组织，12,000g 4 oC 离心10 分钟，小心吸掉zui上面的油层，弃去。
再取裂解液，弃管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。
3. 加入0.2 体积的氯仿(0.2ml)，充分颠倒混匀，冰上孵育1-5 分钟，溶液开始分相。有时分相不明显，
不影响提取。
4. 离心12,000 ? g 4 oC 10 分钟，溶液分为两相。RNA 在上层水相，下层为有机相，两相界面是一层薄膜
其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出0.5ml 上层水相转移到新离心管。
注意：取上清液时应保留0.5-1 mm 厚的水相，以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入，应
将所取的上清液放回管中并重新离心10 分钟，再次吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易
导致RNA 降解和DNA 污染。如需同时提取DNA 或蛋白质，则保留中间相和下层有机相，向公司
索要操作方法。
5. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于上清液充分混匀。冰上孵育10 分钟沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间
进行沉淀并不必要。如果起始组织细胞的量很少，－20 oC 放置一至数小时可沉淀几乎所有的RNA。
注意：从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取RNA 时，按以下步骤进行：以每1 ml Trizol
裂解组织，加氯仿后离心得到约0.5 ml 上清液计算，分别加入上清液一半体积即0.25 ml 的高盐溶液(0.8
M 柠檬酸钠和1.2 M NaCl)和0.25 ml 异丙醇，混匀。执行下面的离心沉淀步骤6。离心后可有效沉淀RNA，
但多糖或糖原存留在上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取RNA 时，推荐使用植物RNA 分离
试剂Plant Trizol 或Plant RNA Extraction Kit。
6. 12,000 g，4 oC 离心10 分钟。管底可见少许RNA 沉淀。
注意：如初始组织细胞量少，RNA 将附着在管壁，用肉眼几乎难辨沉淀，但不影响实验。如RNA 沉淀量很多
并呈胶冻状，通常表明有蛋白污染。应仔细检查操作步骤。
7. 弃上清。立即加入1 ml 75%乙醇，颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 g 离心5 分钟。弃上清，尽量*
吸去管壁上的液体。
注意：乙醇洗涤后RNA 沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA 沉淀。RNA 沉淀在75%乙醇中可在4 oC
保存一周或在－20 oC 保存一年。
8. 敞开管口，空气干燥5-10 分钟使残留液体挥发，RNA 略微沉淀干燥即可。用50-100 ?l 自备的DEPC 处
理的高压消毒纯水或TE 溶解沉淀。RNA 溶液可保存于－70 oC 或液氮中。
注意：过分干燥将使RNA 难以溶解。55 oC 加热或反复冻融数次可以助溶。RNA 溶液加3 倍体积乙醇冻存于
－20 oC，用时离心沉淀。
说明：
1. 每100 mg 组织RNA 预期得率为：肝脾60－100 ?g, 肾50 ?g, 脑组织10-15 ?g, 胎盘20－40 ?g, 脂
肪50 ?g。1 x 107 个细胞通常得50－100 ?g。
2. 测定OD 值，根据OD260 计算RNA 浓度。OD260/280 比值可初步判断RNA 质量，比值在1.6-2.0 之间均
属正常。起始组织量过大，或吸取了有机相或碎片，将使RNA 样品中蛋白和杂质含量高，RNA 沉淀乙醇
洗涤不充分(步骤8)，均可导致OD260/280 比值降低。例如，RNA 用水溶解或pH 偏酸OD260/280 偏低，
用TE 或离子强度较高的溶液溶解时较高，但均不影响RNA 后续使用。切记即便是已降解的RNA，
OD260/280 比值也能达到看似的2.0 左右，因此该比值并非判断RNA 降解与否*的指标。判断RNA
质量的*途径是进行普通RNA 琼脂糖电泳检查RNA 完整性。
3. 检查RNA 完整性。取1 ?g RNA 样品进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外灯观察。28S RNA~5
kb 亮度应该约为18S RNA~2 kb 的两倍，有时可见0.1-0.3 kb 的5S RNA。
4. 调整RNA 溶液的体积或重沉淀RNA。(1) 加入适量DEPC 处理过的高压消毒纯水或TE 缓冲液，于RNA 溶
液中，使溶液体积补齐到约400 ?l；(2) 加入0.1 体积的3M 醋酸钠pH 5.2，混匀；(3) 加入2.5
体积的纯乙醇，混匀；(4) 冰上孵育10 分钟；(5) 12,000g 4 oC 离心10 分钟，弃上清；(6) 执行上
述RNA 提取程序的步骤6－8。
5. Trizol 勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤，立即用大量水清洗。