H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的如何制备及ELISA诊断方法的建立

研究采用高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作为免疫原，免疫8周龄BALB／C雌性小鼠，三次加强免疫后取脾细胞与SP2／0细胞融合，用血凝抑制试验（HI）方法检测筛选，阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养，zui后获得两株H7亚型HA特异性单抗6H4和7F6，亚类分别为IgG2a、IgG2b，轻链都为k链，经检测具有良好的特异性。采用纯化的HPAIV A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作为免疫原，灭活后加入弗氏*佐剂和不*佐剂制成疫苗多次免疫山羊，获得抗H7亚型禽流感的高免羊血清。 用羊血清作为捕获抗体，H7亚型特异性单克隆抗体为检测抗体，建立了检测H7亚型高致病性禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化，获得的*工作条件为：羊血清1：1000倍稀释，单抗1：40000稀释，酶标抗体为1：5000倍稀释，一抗反应时间1.5h，酶标抗体作用时间1.5h。 用建立的抗原捕捉ELISA方法对已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽类病毒以及其他15个HA亚型禽流感标准病毒株进行交叉反应性试验，结果表明：建立的H7亚型高致病性禽流感抗原捕捉ELISA方法和其他禽类病毒以及其他亚型禽流感病毒均没有明显的交叉反应性，说明该方法对H7亚型高致病性禽流感病毒具有很好的特异性。 与血凝试验（HA）和鸡胚接种试验相比，本实验建立的抗原捕获ELISA方法较HA敏感2倍以上，但不如鸡胚接种试验敏感。 利用优化的ELISA反应条件对人工感染的研究样本进行检测，通过对脾脏、肾脏、心脏、肺脏等多份阴阳性样本的检测zui终确定以心脏作为研究检测的靶器官，并将0.099（OD_（490nm））作为脏器的阴阳性判定标准。 将试验用的各种试剂及包被的反应板组装成试剂盒，同时保存于室温、4℃和-20℃，定期进行检测，结果表明：试剂盒在室温保存时极不稳定，保存期限很短，4℃和-20℃条件下都可以保存3个月以上。