信帆生物：WB（免疫印记）实验的样本取材和邮寄方法

信帆生物：WB（免疫印记）实验的样本取材和邮寄方法

以下所有样本必须在送样管上标记清楚样本编号，-80℃冰箱冻存（-80℃冻存时间不超过一个月，避免反复冻融导致蛋白降解），全程干冰运输送样。

一、动物组织样本

1、动物处死后5min内取样，全程冰上操作，先取易降解的组织，如胰腺、肠、胃等，再取其它组织，组织块至少取50mg以上（黄豆大小）。组织取好后用预冷的PBS轻轻漂洗掉样本表面的血污，例如心、肝、脾、肾等血污较多的组织，可用预冷PBS清洗多次，直至血污清洗干净，用滤纸吸干组织表面液体，立即放入EP管或冻存管中-80℃保存。

2、肠，胃，血管，食管，子宫等标本，取材后立即把组织切开用预冷PBS清洗多次，去除内容物，用滤纸吸干组织表面液体，立即放入EP管或冻存管中-80℃保存。

3、脊髓，主动脉，气管，神经等标本长度不得少于1cm。

4、视网膜需单独剥离，小鼠至少需要4个视网膜合并，大鼠至少需要2个视网膜合并。

5、卵巢需单独剥离，去除周围脂肪，小鼠至少需要2个卵巢合并。

6、皮肤样本需去净毛发。

如有特殊特定部位请提供详细取材要求或参考图。

二、细胞样本（细胞量至少10⁶，细胞沉淀绿豆大小）

1、悬浮细胞：

①将细胞及培养基一起吸入离心管中，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀。

②加入1mL PBS溶液重悬细胞，将细胞转移到1.5mL离心管中，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀，细胞沉淀要有绿豆大小。

2、贴壁细胞：

方法一：消化法

①培养好的细胞弃培养基，加入胰酶消化。

②胰酶消化后（时间不宜过长），加培养基终止消化，轻轻吹打至细胞悬浮。吸入离心管，4℃低速离心（不超过3000rpm），5min。

③弃上清，加PBS重悬细胞，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀，细胞沉淀要有绿豆大小。

方法二：刮取法

①培养好的细胞弃培养基，加入PBS，用细胞刮沿一个方向轻轻刮下细胞，切记不要反复刮，避免细胞刮破。

②细胞液收集至离心管内，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀，细胞沉淀要有绿豆大小。

备注：不要寄送培养板或培养瓶，运输过程中细胞容易脱落且造成细胞活力下降，培养板有漏液风险，造成样本污染。

三、菌液，外泌体，血清，细胞上清等，一个指标至少20μL，浓度1μg/μL以上，-80℃保存。

四、全血样本至少1mL，抗凝管4℃保存运输，保存时间不要超过5天，凝血的样本不能用于WB检测。

五、提取好的蛋白变性后干冰运输。建议按以上方法提供样本在我司提取蛋白。

注：提取特殊蛋白，如膜蛋白，线粒体蛋白，核蛋白所需样本量要翻倍，即组织100mg以上，细胞沉淀量黄豆大小。

具体蛋白提取方法如下：

细胞总蛋白提取：

1、悬浮细胞裂解步骤：

①培养细胞量至10⁶，将细胞及培养基一起吸入离心管中，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀。

②加入1mL PBS溶液重悬细胞，将细胞转移到1.5mL离心管中，4℃低速离心（不超过3000rpm）5min，去上清，收集细胞沉淀。

③根据细胞沉淀量加入10倍体积的全裂解液（全裂解液配方：RIPA裂解液(G2002)+50*cocktail(G2006)+PMSF(100mM)(G2008)+磷酸化蛋白酶抑制剂(G2007)，比例是100:2:1:1，使用前加入蛋白酶抑制剂），沉淀体积为绿豆大小（大概20μL）加入200μL全裂解液（如需提高蛋白浓度，可适量减少裂解液体积），冰浴30 min；（期间每隔5min将离心管放置涡旋混匀仪（SMV-4500B）震荡混匀，整个过程必须在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

2、贴壁细胞裂解步骤：

①培养细胞量至10⁶，倒掉培养基，沿平皿侧壁或者培养瓶瓶口缓慢加入PBS溶液（G2156-1L）轻轻摇晃润洗，然后将细胞培养板/瓶倾斜放置，用移液器轻轻吸除残余液体，清洗2次，最后一次将残余PBS全吸净（清洗过程需轻柔操作，不要将细胞冲掉）。

②加入适当体积的全裂解液，单孔加入250μL全裂解液（如需提高蛋白浓度，可适量减少裂解液体积），反复晃动，让裂解液与细胞充分接触，用细胞刮刀刮下细胞，将裂解液及细胞收集到1.5mL EP管中，冰浴30 min（期间每隔5min将离心管放置涡旋混匀仪震荡混匀，整个过程必须在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

裂解完成后，12000rpm，4℃，离心10min，取上清放入新的1.5mL EP管（EP-150-M）

中，上清即为总蛋白溶液（EP管上需写清楚样本编号）。

组织总蛋白提取：

1、组织块用预冷的PBS洗涤2~3次，去除血污，剪成小块置于匀浆管（HT-200-M）中，加入2颗4mm的研磨珠（G0204-150G），加入10倍组织体积的全裂解液（使用前加入蛋白酶抑制剂）（如需提高蛋白浓度，可适量减少裂解液体积），设置低温研磨仪（KZ-III-FP）匀浆程序进行匀浆。

2、匀浆完成后，冰浴30 min（期间每隔5min将离心管放置涡旋混匀仪震荡混匀，整个过程必须在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

3、裂解全后12000rpm，4℃，离心10min，取上清放入新的1.5mL EP管中（不要吸到底部沉淀），即为总蛋白溶液（EP管上需写清楚样本编号）。

信帆生物：WB（免疫印记）实验的样本取材和邮寄方法