过氧化氢

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测定意义：

H₂O₂是生物体内常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H₂O₂也是许多氧化应急反应中的关键调节因子，。

测定原理：

H₂O₂与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮60mL、浓盐酸10mL、研钵和冰。

试剂的组成和配制：

试剂一：丙酮100mL×1瓶，4℃保存；（自备）

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4℃保存；

试剂三：液体×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体×1瓶，4℃保存；

H₂O₂提取：

1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样品的制备：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

注意事项：

1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。

2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。

测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至415nm，蒸馏水调零。
2. 将试剂二、三和四37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
3. 在EP管中按顺序加入下列试剂

4000g，常温离心10min，弃上清，留沉淀

加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值。对照管只要做一次即可。计算ΔA＝A测定-A对照。

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