关于明胶酶谱法试剂盒脱色液配方的注意事项

关于明胶酶谱法试剂盒脱色液配方的注意事项！

本公司销售的基质金属蛋白酶MMP2/MMP9明胶酶谱试剂盒，其中脱色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V），很多老师不明年这里面的冰醋酸是什么，我们今天给大家讲解一下。

这个冰醋酸不是醋酸也不是乙酸，冰醋酸也叫冰乙酸，就是纯的无水乙酸。不过我们选择常规的98%乙酸也是可以的。

检测步骤：

1. 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 TEMED，等待凝胶聚合。

2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染  Marker 即可。阳 性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。

3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。

6.  显色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出现透明条带。

7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色.MMP条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

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