镍琼脂糖凝胶

镍琼脂糖凝胶

英文名称：Ni-Berpharose FF

货号：B2824

规格：1ml

1.      产品介绍

镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），之后螯合Ni2+。IDA是金属螯合层析中最-常用的配体，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有亲和力强、载量高、可再生重复使用等优点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化含有组-氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。组-氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基质上，可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。

2.规格

1ml（预装柱）、5ml（预装柱）、10ml（预装柱）、20ml、100ml、500ml 纯化流程

①平衡

镍-琼脂糖凝胶FF柱用2~5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。

建议流速为100 cm/h。

②上样

（1）样品一般溶解于pH6~8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。

（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。

（3）常用缓冲液有10~100 mM磷酸钠缓冲液、20~200 mM Tris-HCl缓冲液等。

（4）缓冲液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。

（5）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl,pH 7.4）作为初始缓冲液。

③洗脱

（1）增加咪唑浓度进行洗脱是镍-琼脂糖凝胶FF最-常用的洗脱方法。

（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。

（3）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低

到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。

（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。

洗脱方法

（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来（也可以在pH 3~4），缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。

（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0~0.5M咪唑、0~50 mM组-氨酸、0~2M NH4Cl）。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH值下进行。

（3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。

注：降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。最-常用的方法为竞争性洗脱。

上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入150 ~500mM的NaCl以消除离子交换作用。

5.再生、清洗、保存

①凝胶再生

（1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法：用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5~10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，最后用2~3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脱镍后一般需要进行清洗。清洗方法：用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1~2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。

（3）清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2~5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子，用0.1~0.3 M金属盐溶液过柱5~10个柱体积以螯合金属离子，之后用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。

②在位清洗

（1）去除因离子交换作用吸附的蛋白：2~3个柱体积的2 M NaCl溶液反向清洗。

（2）去除强疏水性蛋白和脂质等：4个柱体积的70%乙醇或者30%异丙醇反向清洗。

（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：参照凝胶再生步骤。

6.注意事项：

1)使用时保证柱子和缓冲液的温度一致，避免柱床内产生气泡，影响纯化效果。

2)本产品保存条件为20%乙醇，4~8℃。

3) 2-25℃,常压,避光运输

4）仅供科研实验使用

镍琼脂糖凝胶