钴琼脂糖凝胶

钴琼脂糖凝胶

英文名称：Co-Berpharose FF-NTA

货号：B2779

1.      产品介绍

钴-琼脂糖凝胶FF(NTA)以琼脂糖微球为基质，活化偶联次氮基三乙酸（NTA），之后螯合Co2+。钴 NTA 琼脂糖凝胶 FF 具特异性好，螯合钴更稳定，不易脱落，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好。

钴-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化含有组-氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。组-氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Co2+的基质上，可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。

2.规格

1ml（预装柱）、5ml（预装柱）、10ml（预装柱）、20ml、100ml、500ml

（3）常用缓冲液有10-100 mM磷酸钠缓冲液、20-200 mM Tris-HCl缓冲液等。

（4）缓冲液中一般要加入0.15-0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。

（5）初次使用钴-琼脂糖凝胶FF时，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4）作为初始缓冲液。

③洗脱

（1）增加咪唑浓度进行洗脱是钴-琼脂糖凝胶FF最-常-用的洗脱方法。

（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。

（3）初次使用钴-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低

到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。

（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。

洗脱方法：

（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH4-6会被洗脱下来（也可以在pH 3~4），缓冲液可以是醋狻钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。

（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0-0.5M咪唑、0-50 mM组-氨酸、0-2M NH4Cl）。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH值下进行。

（3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。

注：降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。最-常-用的方法为竞争性洗脱。

上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入150 -500mM的NaCl以消除离子交换作用。

5.再生、清洗、保存

①凝胶再生

（1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱钴再生。脱钴方法：用5-10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5-10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，最后用2-3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脱钴后一般需要进行清洗。清洗方法：用0.1-1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1-2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。

（3）清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2-5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱钴后的柱子，用0.1-0.3 M金属盐溶液过柱5-10个柱体积以螯合金属离子，之后用5-10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。

②在位清洗

（1）去除因离子交换作用吸附的蛋白：使用1.5M NaCl 溶液接触时间为10-15 分钟清洗，然后，再使用去离子水清洗10 个柱体积。

（2）去除强疏水性蛋白和脂质等：通过使用30%异丙纯清洗5-10 个柱体积，接触时间为15-20 分钟可以去除此类污染物。然后，再使用10 倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液， 清洗填料2 倍柱体积。例如，含有0.1–0.5%  非离子去污剂的0.1 M  醋狻溶液，接触时间 为1–2  小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5 个柱体积，以彻-底去除去污剂。 最后使用10 倍柱体积的去离子水清洗。

（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：参照凝胶再生步骤。

6.注意事项：

1)使用时保证柱子和缓冲液的温度一致，避免柱床内产生气泡，影响纯化效果。

2)本产品保存条件为20%乙醇，4-8℃。

3) 2-25℃,常压,避光运输

4）仅供科研实验使用

钴琼脂糖凝胶