免疫荧光双标三色（双宽玻片）

免疫荧光双标三色（双宽玻片）

服务介绍：

免疫荧光双重标记即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上两个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析。

实验流程：

　　异源双标：

1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液10min-环保型脱蜡液10min-环保型脱蜡液10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。

2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min至沸，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3、 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）

4、 血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加驴血清）

5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，两种一抗按一定的稀释比例混合，滴加到组织上，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的按一定比例配好的二抗覆盖组织，室温孵育50min。（两种二抗，按照一定的比例混合孵育）

7、 DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

8、 自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

9、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10、 镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光. CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712。 DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光，绿光 。

　　同源双标：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。

2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3、 画圈,双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

4、 血清封闭: 甩干PBS, 滴加BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）

5 、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6 、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7 、加CY3-TSA（或FITC-TSA）：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

8 、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9、 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

10、 加对应的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11、 DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

12、 自发荧光淬灭：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

13 、封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

14 、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光.

同源双标技术原理介绍：

主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA是一种基于辣根过氧化物酶HRP的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。技术主要原理为荧光标记的酪胺在HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺，附着在靶标周围的蛋白酪-氨酸残基上。此结合是共价结合，而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合，通过微波修复处理，第一轮的一抗二抗被洗脱，荧光标记的酪胺依然附着在靶标周围。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需变化不同荧光标记即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色

送样运输要求：

1.冰冻切片-20℃保存和运输。

2.石蜡切片常温运输至实验室。

3.细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS洗涤后用无菌PBS浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室